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關(guān)于生物固氮原理應(yīng)用及研究進(jìn)展
摘要：生物固氮是自然生態(tài)系統(tǒng)中氮的主要來(lái)源全球生物固氮的量是巨大的，海洋生態(tài)系統(tǒng)每年生物固氮量在四百萬(wàn)噸到兩千萬(wàn)噸，陸地生態(tài)系統(tǒng)生物固氮量在九百萬(wàn)噸到一千三百萬(wàn)噸，而工業(yè)固氮量在世紀(jì)年代中期每年約為一千三百萬(wàn)噸�？梢�，生物固氮在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和氮素生態(tài)系統(tǒng)平衡中的作用很大我國(guó)農(nóng)民利用豆科植物固氮肥田歷史悠長(zhǎng)，直至現(xiàn)在仍保留著豆科植物和非豆科植物輪作套作和間作等耕作制度國(guó)外也十分重視固氮生物在農(nóng)業(yè)中的作用。
關(guān)鍵詞：生物固氮；聯(lián)合固氮菌；自生固氮菌
一、生物固氮的原理
1982年，Postage以肺炎克氏菌為例提出一個(gè)固氮酶催化機(jī)理模式，至今仍被廣泛采用其總反應(yīng)式為：N2+6H++nMg-ATP+6e-(酶)→2NH3+nMg-ADP+nPi固氮微生物的固氮過(guò)程是在細(xì)胞內(nèi)固氮酶的催化作用下進(jìn)行的不同固氮微生物的固氮酶，其催化作用的情況基本相同在固氮酶將還原成的過(guò)程中，需要e和H+，還需要ATP提供能量生物固氮的過(guò)程十分復(fù)雜[1]，簡(jiǎn)單地說(shuō)，即在ATP提供能量的情況下，e和H+通過(guò)固氮酶?jìng)鬟f給N2，使它們還原成NH3，而乙炔和N2具有類似的接受e還原成乙烯的能力。
二、固氮微生物的種類
固氮微生物多種多樣，不同的劃分標(biāo)準(zhǔn)滿足了不同的要求。從它們的生物固氮形式來(lái)分，有自生固氮、聯(lián)合固氮、和共生固氮3種。
①自生固氮微生物是指能夠在自由生活狀態(tài)下固氮的微生物總稱。在自然界，自生固氮微生物種類很多，分散地分布在細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌的不同科、屬和不同的生理群中；并大致可以分為光合細(xì)菌和非光合細(xì)菌兩類。前者如紅螺菌、紅硫細(xì)菌和綠硫細(xì)菌等，其中的某些種類可與其它微生物聯(lián)合而相互有利；后者的種類很多。根據(jù)非光合細(xì)菌的自生固氮菌對(duì)氧的需求，可以分為厭氧的細(xì)菌如梭狀芽胞桿菌[2]；需氧細(xì)菌如自生固氮菌、貝捷林克氏固氮菌、固氮螺菌等；以及兼性細(xì)菌如多粘芽胞桿菌、克魯伯氏桿菌、腸桿菌等。自生固氮微生物中的某些種類，在有些情況下可以與植物進(jìn)行聯(lián)合固氮。
一般地，自生固氮微生物固定的氮素滿足本身生長(zhǎng)繁殖需要以后就不再固氮了，多余的氮反過(guò)來(lái)會(huì)抑制它們自身的固氮系統(tǒng)。同時(shí)，它們固氮效率也比較低。
據(jù)測(cè)定，每消耗1克碳水化合物，自生固氮微生物固定10毫克氮，而共生固氮的根瘤菌則可以固定270毫克氮。所以，這個(gè)類群的微生物從固氮量的角度衡量，對(duì)作物的氮素供應(yīng)的貢獻(xiàn)并非很大。許多試驗(yàn)結(jié)果證明，這類微生物所產(chǎn)生的各種激素和其它活性物質(zhì)是促進(jìn)作物生長(zhǎng)的主要因素之一。
②聯(lián)合固氮微生物有些自生固氮微生物在特定植物根際環(huán)境中生長(zhǎng)、繁殖比非根際土壤中旺盛得多，這是由于植物根系的分泌物和脫落物提供能源物質(zhì)，固氮微生物利用這些能源物質(zhì)生活和固氮，這種互利關(guān)系稱之為聯(lián)合固氮。聯(lián)合固氮體系最先是在雀稗和雀稗固氮菌之間發(fā)現(xiàn)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)小麥、水稻和C4作物如甘蔗、玉米、高粱等禾本科植物亦存在聯(lián)合固氮體系。能夠進(jìn)行聯(lián)合固氮的微生物種類較多，似乎沒有什么特異性[2,3]，有些微生物既可以在自生條件下進(jìn)行自生固氮作用，又能在田間與一些禾本科作物進(jìn)行聯(lián)合固氮作用。已經(jīng)報(bào)道過(guò)的聯(lián)合固氮的主要微生物種類有：浸麻芽胞桿菌、多粘芽胞桿菌、巴西固氮螺菌、含脂固氮螺菌、克魯伯氏桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和糞產(chǎn)堿桿菌等。與共生固氮相比，聯(lián)合固氮微生物與植物之間的關(guān)系不緊密，雙方也沒有共同的組織結(jié)構(gòu)，因而固氮效率也不可能高。目前，對(duì)于聯(lián)合固氮體系的固氮量很難有一個(gè)比較準(zhǔn)確的估計(jì)，一般認(rèn)為每畝地每年約為0.5～1斤純氮。
③共生固氮微生物是指能與宿主植物形成特定固氮組織結(jié)構(gòu)的一類微生物。它們彼此生活在一起，植物向微生物提供光合產(chǎn)物供微生物固氮需要，微生物則向植物提供氮素營(yíng)養(yǎng)，雙方互相有利。以豆科植物--根瘤菌共生體系來(lái)說(shuō)，由于有根瘤組織作為它們的共生結(jié)構(gòu)，共生效率是最高的。其原因是這種共生體系滿足了上述所說(shuō)的生物固氮的條件。已知的比較清楚的共生體系除了豆科植物--根瘤菌共生體系外，還有非豆科植物--固氮放線菌體系和紅萍--固氮藍(lán)藻共生體系。與相應(yīng)的豆科植物共生固氮的根瘤菌很多，迄今從豆科植物根瘤中分離出來(lái)并進(jìn)行過(guò)研究的約有100多種，在生產(chǎn)上應(yīng)用的種類不足1/5。在分類上確定了分類地位的現(xiàn)在有5個(gè)屬，它們分別是：根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、固氮根瘤菌屬和中慢生根瘤菌屬。每個(gè)根瘤菌屬包括至少1個(gè)種。和上述的自生固氮和聯(lián)合固氮比較，共生固氮效率高，固氮量多，對(duì)于人類的意義和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的作用也最大[4]。迄今研究最為清楚、應(yīng)用最多的是豆科植物根瘤菌共生固氮體系，據(jù)測(cè)定，一般每年每畝固定純氮約為13.3公斤，約折合每畝地每年固定標(biāo)準(zhǔn)化肥130斤，且?guī)缀跞勘焕谩?/p>
三、當(dāng)前生物固氮的主要研究方法有哪些
在固氮生物研究中，最經(jīng)典的測(cè)定技術(shù)是凱氏定氮法其后，由于同位素示蹤法的出現(xiàn)，采用了15N示蹤法測(cè)定固氮量，比凱氏法的靈敏度提高1000倍。1966年以來(lái)，應(yīng)用乙炔還原法測(cè)定固氮酶活性是生物固氮研究中的一大突破，這一革新把生物固氮研究推向了一個(gè)新的階段其靈敏度比15N示蹤法還要高1000倍，而且方法簡(jiǎn)單速度快，適于生物固氮方面研究，氮累計(jì)法該方法在生物固氮早期研究中成功運(yùn)用過(guò)，但準(zhǔn)確率較低。
示蹤法：在固氮研究中，目前15N穩(wěn)定性同位素被認(rèn)為是最有效而實(shí)用的工具。15N示蹤法的靈敏度比常規(guī)凱氏定氮法高1000倍，且不需校正因子但其缺點(diǎn)是：（1）15N的價(jià)格較昂貴，需用較為復(fù)雜的質(zhì)譜儀測(cè)定；（2）測(cè)定的手續(xù)較繁瑣，不易準(zhǔn)確定量；（3）其靈敏度較乙炔還原法低1000倍。該方法是用塑料袋先將植物封住，抽出里面的空氣，導(dǎo)入高豐度的15N，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后取出樣本，用凱氏定氮法消化蒸餾，用Hg2+或CUSO4作催化劑，把15N轉(zhuǎn)化為15NH4，在高真空中用次溴酸鹽將15NH4轉(zhuǎn)化為15N2，直接導(dǎo)入質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析[5]。
同位素稀釋法：同位素稀釋質(zhì)譜法是通過(guò)同位素豐度的精確質(zhì)譜測(cè)量和所加入稀釋劑的準(zhǔn)確稱量，求得待測(cè)樣品中某元素的絕對(duì)量，有效地把元素的化學(xué)分析轉(zhuǎn)變?yōu)橥凰販y(cè)量，因此具有同位素質(zhì)譜測(cè)量的高精度和化學(xué)計(jì)量的高準(zhǔn)確度但其缺點(diǎn)非常明顯：（1）需要濃縮同位素，成本高；（2）樣品制備復(fù)雜，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，易受污染乙炔還原法1966年，RSchoollhorn和RHBurris以及澳大利亞Murdoch大學(xué)的MJDilworth發(fā)現(xiàn)固氮酶可以使乙炔還原為另一種氣體---乙烯年等用這種方法對(duì)自生固氮菌固氮酶提取液大豆根瘤等做了測(cè)定也對(duì)大豆根瘤進(jìn)行了測(cè)定1968年，乙炔還原法測(cè)定活性已成為國(guó)際上固氮研究中最重要的測(cè)定技術(shù)乙炔還原法靈敏度高，比示蹤法高1000倍，而且方法簡(jiǎn)單速度快除此之外，它還可進(jìn)行生物固氮各方面的研究如自生固氮菌細(xì)胞或酶的提取液豆科或非豆科根瘤藻類禾本科植物根際聯(lián)合固氮等等它可以離體測(cè)定，也可以整株活體連續(xù)測(cè)定或原位測(cè)定該方法是將待測(cè)材料置于容器中，注滿乙炔，反應(yīng)一定時(shí)間后，用氣相色譜儀測(cè)定乙烯的生成量，以單位時(shí)間內(nèi)一定量樣品所產(chǎn)生的乙烯量來(lái)表示固氮酶活性此法速度快，靈敏度高這一方法的建立使生物氮研究方法取得了重
要突破[6,7,8]。
15N自然豐度法：自確定用大氣中15N豐度作為的標(biāo)準(zhǔn)自然豐度以來(lái)，利用
15固氮植物和非固氮植物利用有效氮源的不同而形成的植物N豐度的差異來(lái)測(cè)
定生物固氮量，已逐漸成為一種應(yīng)用范圍較廣的定量研究生物固氮手段，即自然豐度法這是目前國(guó)際上日益受到重視的一種方法，精度和同位素稀釋法接近，但成本便宜。
四、聯(lián)合固氮菌目前的研究進(jìn)展及未來(lái)研究方向
聯(lián)合固氮菌是固氮生物中重要的類群，在為植物特別是糧食作物提供氮素、降低化肥用量、減少環(huán)境污染、維持生態(tài)平衡和促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面發(fā)揮著重要作用，并因此成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。由于聯(lián)合固氮細(xì)菌與植物之間是一種松散的結(jié)合，未能形成穩(wěn)定的共生結(jié)構(gòu)，因而受根際土壤因素的影響較大，這也給聯(lián)合固氮菌的研究帶來(lái)一些困難。目前聯(lián)合固氮作用研究主要有以下方面:①聯(lián)合固氮菌的鑒定及其在植物根部的定位觀察。②對(duì)聯(lián)合固氮體系建立過(guò)程中的形成機(jī)理和根際微生態(tài)系統(tǒng)中植物、土壤和細(xì)菌三者間的作用機(jī)理的闡明。③由于結(jié)合態(tài)氮是抑制固定大氣氮的主要因素，如何獲得能高效固氮的耐銨型菌株是亟待解決的問題之一[9]。④聯(lián)合固氮菌之間的相互關(guān)系及協(xié)同作用。⑤將聯(lián)合固氮菌引入禾本科植物根內(nèi)，誘導(dǎo)植物形成固氮根瘤。⑥固氮能源的供給及組成。雖然聯(lián)合固氮的固氮效應(yīng)不及共生固氮高，但其分布廣，受益作物多，因此對(duì)于非豆科植物而言[11,12]，聯(lián)合固氮可能成為將來(lái)農(nóng)、林、牧業(yè)中潛在的穩(wěn)定氮源，其生態(tài)意義和經(jīng)濟(jì)效益都是不可低估的。
五、自生固氮菌目前的研究進(jìn)展及未來(lái)研究方向
有些高等植物與菌根真菌共生形成菌根，非豆科固氮植物固氮能力強(qiáng)，是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的供氮系統(tǒng)，植物內(nèi)生菌與寄主植物在長(zhǎng)期的共同進(jìn)化過(guò)程中形成共生關(guān)系[13]。它們通過(guò)固氮作用，產(chǎn)生生理活性物質(zhì)促進(jìn)宿主對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，在農(nóng)業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力。近年來(lái)，在甘蔗、玉米中發(fā)現(xiàn)了多種具有固氮功能的內(nèi)生細(xì)菌，引起了學(xué)術(shù)界的高度關(guān)注。
這一發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)生物固氮調(diào)控有重要意義，也是對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)研究中的一項(xiàng)重要貢獻(xiàn)。它為進(jìn)一步研究光合和固氮之間的聯(lián)系，提供了理論基礎(chǔ)。
如果固氮微生物體內(nèi)具有氫酶，可以吸收氫產(chǎn)生的能量。這樣，就能提高其
固氮效率而增加產(chǎn)量。
目前，利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)移固氮基因從而使植物表達(dá)固氮作用已成為一項(xiàng)世界性的戰(zhàn)略課題。許多國(guó)家的科學(xué)家都在運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)從事固氮菌的固氮機(jī)理和轉(zhuǎn)移微生物固氮能力等各方面的研究，展現(xiàn)固氮菌生物固氮的前景。針對(duì)目前固氮菌研究中存在的問題，目前關(guān)于固氮菌的發(fā)展主要集中在以下幾個(gè)方面
[14]：
1、改進(jìn)現(xiàn)有固氮微生物的固氮效率
改變固氮酶作用中的放氫耗能反應(yīng)。由于固氮作用要消耗一定的能量，即消耗了植物光合作用的產(chǎn)物。因此可以設(shè)想，應(yīng)用基因工程手段，組建菌株，使釋放的能量再用于固氮酶的固氮作用[8]。培養(yǎng)菌株，解除抑制固氮酶合成，使固氮菌環(huán)境中能結(jié)瘤固氮。
2、利用生物工程技術(shù)，構(gòu)建新的固氮微生物
原核生物間的遺傳性能轉(zhuǎn)移是比較容易的。應(yīng)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)移培育高效固氮的根際細(xì)菌群，開辟根際細(xì)菌轉(zhuǎn)人固氮質(zhì)粒的研究[15,16]。
3、建立新的共生固氮體系
共生固氮體系是生物界中最有效的固氮組合。固氮作用所需要的能量來(lái)自宿主植物的光合作用。固氮產(chǎn)物直接為宿主的氮素營(yíng)養(yǎng)，共生的兩方面相互有利，相互支持。但是，對(duì)農(nóng)、林和牧業(yè)生產(chǎn)有價(jià)值的共生固氮體系，在自然界中僅限于少數(shù)微生物與有限的豆科植物共生。研究擴(kuò)大根瘤菌的共生范圍，使能在其它植物上結(jié)瘤固氮�；�?qū)⒐痰驅(qū)敫叩戎参锛?xì)胞，創(chuàng)建能固氮的高等植物，自給氮素營(yíng)養(yǎng)的植物類型是非常有意義的。
4、加強(qiáng)固氮菌遺傳工程的研究
從目前的研究現(xiàn)狀來(lái)看，試圖通過(guò)基因工程將固氮基因(nif)從豆科植物轉(zhuǎn)移到非豆科農(nóng)作物中難度比較大，在短期內(nèi)很難實(shí)現(xiàn)，而采用細(xì)胞工程方法將根瘤菌導(dǎo)入非宿主農(nóng)作物細(xì)胞內(nèi)則切實(shí)可行[17,18,19]。
5、建立新的共生固氮體系
由于Frankia菌具有對(duì)宿主的侵染范圍寬、固氮活性比較強(qiáng)和對(duì)氨氣不敏感等特性，在生物固氮研究中對(duì)Frankia茵的研究將更為重要，有可能由此會(huì)找到新的突破口。在Frankia菌與農(nóng)作物之間建立起新的共生固氮體系將具有更大的的可能性。
隨著生物科學(xué)的快速發(fā)展和對(duì)環(huán)境保護(hù)的日益重視，固氮菌必將引起更多的關(guān)注與研究，固氮微生物在農(nóng)業(yè)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)、工業(yè)生產(chǎn)等方面的應(yīng)用將更加深入的展開，人類也將從中獲益匪淺。
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