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生物分離實(shí)驗(yàn)案例
生物分離工程實(shí)驗(yàn)是一門(mén)應(yīng)用性很強(qiáng)的課程，通過(guò)對(duì)這門(mén)課的學(xué)習(xí)，使得學(xué)生能夠系統(tǒng)掌握生物活性物質(zhì)的提取、分離、純化和加工的整個(gè)流程，以下是小編為大家整理的生物分離實(shí)驗(yàn)案例，歡迎閱讀與收藏。
生物分離實(shí)驗(yàn)案例 1
實(shí)驗(yàn)一：牛乳中酪蛋白的提取
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1、掌握等電點(diǎn)法提取蛋白的基本原理及基本操作；
2、掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白含量的基本原理及基本操作。
二、實(shí)驗(yàn)原理
酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類(lèi)蛋白質(zhì)，約占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì)，是一類(lèi)含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結(jié)合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L，比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)，可以檢測(cè)牛乳中是否摻假。
酪蛋白在其等電點(diǎn)時(shí)由于靜電荷為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，經(jīng)牛乳調(diào)到pH4.6，酪蛋白就從牛乳中分離出來(lái)。酪蛋白不溶于乙醇，這個(gè)性質(zhì)被利用來(lái)從酪蛋白粗制劑中將脂類(lèi)雜質(zhì)除去。
在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一個(gè)常需測(cè)定的指標(biāo)。常用于測(cè)定酪蛋白的方法是先將酪蛋白在等電點(diǎn)沉淀，再用凱氏定氮法測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用雙縮脲法測(cè)定酪蛋白。其原理為：蛋白質(zhì)含肽鍵，肽鍵在堿性溶液中可與銅離子形成紫紅色化合物，在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸組成無(wú)關(guān)。
三、材料與試劑
市售牛奶
10mg/mL酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（用0.1MNaOH配制）0.1MNaOH溶液、0.2MpH4.6的HAc－NaAc緩沖液
雙縮脲試劑：稱(chēng)取硫酸銅（CuSO4·5H2O）1.5g，加水100mL，加熱助溶；另稱(chēng)取酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化鉀5g溶于500mL水中。兩液混勻后，在攪拌下加入10%NaOH300mL，后用水稀釋至1000mL，貯存于塑料瓶中。此液可長(zhǎng)期保存，若瓶底出現(xiàn)黑色沉淀則需重新配制。
四、操作步驟
1、牛乳中酪蛋白的等電點(diǎn)沉淀
用量筒量取25mL牛乳兩份分別置于50mL燒杯中，水浴加熱至40℃，在攪拌下慢慢加入到已預(yù)熱至40℃的等體積的0.2MpH4.6的HAc－NaAc緩沖液中，混勻，冷卻靜置30min沉淀酪蛋白后，3000r/min離心15min，棄上清液，收集沉淀。一份沉淀用于“除雜”步驟，另一份沉淀用0.1MNaOH溶液溶解并定容至100mL，用于“酪蛋白含量測(cè)定”步驟。
2、除雜
將上述沉淀?yè)v碎，加入10mL95%乙醇，攪拌制成懸浮液。將此懸浮液傾于布氏漏斗中，抽濾除去乙醇溶液，再用10mL乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗滌沉淀兩次，最后再用10mL乙醚洗滌沉淀兩次，抽干。
將沉淀從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開(kāi)揮干乙醚后，置烘箱中80℃干燥過(guò)夜，稱(chēng)重（m1）。
3、酪蛋白含量測(cè)定
�。�1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
分別移取酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于干燥試管中，不足1.0mL者用0.1MNaOH
溶液補(bǔ)足1.0mL，然后分別加入4.0mL雙縮脲試劑，混勻，室溫下反應(yīng)30min，測(cè)定540nm波長(zhǎng)處吸光度。以酪蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
�。�2）酪蛋白含量測(cè)定
取―步驟1‖中樣品溶液1.0mL，加入4.0mL雙縮脲試劑，混勻，室溫下反應(yīng)30min，測(cè)定540nm波
長(zhǎng)處吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得酪蛋白質(zhì)量。平行測(cè)定3次，求其平均值，并計(jì)算25mL牛乳中酪蛋白的質(zhì)量（m2）。
五、結(jié)果與討論
1、牛乳中酪蛋白含量的計(jì)算
含量（g/mL）=
2、酪蛋白提取得率的計(jì)算
得率（%）=
m2?100
牛乳體積（25mL）
m1
100%
m2?100
六、思考題
1、為什么在等電點(diǎn)沉淀時(shí)需加熱至40℃？
2、除雜時(shí)，能否將三種溶劑的順序顛倒？為什么？
3、雙縮脲法測(cè)定蛋白的原理是什么？
4、比較牛乳中酪蛋白測(cè)定含量與理論含量大小，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行討論。
實(shí)驗(yàn)二：大蒜細(xì)胞SOD酶的提取與分離
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1、掌握SOD酶的提取、分離、檢測(cè)等一般步驟；
2、掌握酶在提取過(guò)程中的兩個(gè)重要參數(shù)：回收率和純化倍數(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
超氧化物歧化酶（SOD）是一種就有抗氧化，抗衰老，抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可以催化超氧負(fù)離子（O-）進(jìn)行歧化反應(yīng)，生成氧和過(guò)氧化氫：2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的SOD，通過(guò)組合組織或者細(xì)胞破碎后，可用PH7.8的磷酸緩沖液體提取。由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮將其沉淀析出。
鄰苯三酚在堿性條件下可迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物，在325nm有最大吸收峰。鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物在40s-3min這段時(shí)間，生成物與時(shí)間有較好的線(xiàn)性關(guān)系。顏色深→SOD逐漸增多→顏色淺，即酶活力越大，顏色越淺。
三、試劑和材料
新鮮蒜瓣，市售
磷酸緩沖液：0.05mol/L，pH7.8
氯仿一乙醇混合溶劑：氯仿﹕無(wú)水乙醇=3﹕5（V/V）丙酮：用前冷卻至4～10℃
0.1mol/LTris—HCl緩沖液（pH=8.2，內(nèi)含2mmol/LEDTA）10mmol/LHCl
45mmol/L鄰苯三酚（內(nèi)含10mmol/LHCl）
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1、組織或細(xì)胞破碎
稱(chēng)取5g左右大蒜蒜瓣，置于研缽中研磨，使組織或細(xì)胞破碎。
2、SOD的提取
將上述破碎的組織或細(xì)胞，加入2～3倍體積（10-15mL）的0.05mol/L，pH7.8的磷酸緩沖液，繼續(xù)研磨攪拌20min，使SOD充分溶解到緩沖液中，然后在5000r/min下，離心15min，收集上清液得提取液。
留出1mL備用，剩余提取液準(zhǔn)確量取體積后進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。3、除雜蛋白
提取液加入0.25倍體積的氯仿一乙醇混合溶劑攪拌15min，5000r/min離心15min，去雜蛋白沉淀，收集上清液得粗酶液。
留出1mL備用，剩余粗酶液準(zhǔn)確量取體積后進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。4、SOD的沉淀分離
將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，5000r/min離心15min，得SOD沉淀。
將SOD沉淀溶于少量（5ml）0.05mol/LpH7.8的磷酸緩沖液中，再加水5mL，5000r/min離心15min，收集上清液，得SOD酶液。準(zhǔn)確量取體積。
將上述提取液、粗酶液和酶液分別取樣，測(cè)定各自的SOD活力和蛋白濃度。5、SOD活力測(cè)定
參照李建武的《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD的`酶活力。鄰苯三酚在堿性環(huán)境中即可迅速發(fā)生自氧化作用，在自氧化過(guò)程中產(chǎn)生有色中間物和O2-自由基，反應(yīng)開(kāi)始后溶液逐漸變成黃色，在有超氧化物歧化酶存在時(shí)，由于它能催化O2-自由基與+H結(jié)合生成02和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，降低了自氧化速率。中間產(chǎn)物在325nm時(shí)有強(qiáng)力的光吸收，采用分光光度計(jì)即可檢測(cè)。
（1）鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：
在試管中按表1加入各試劑，加入鄰苯三酚后馬上計(jì)時(shí)，迅速搖勻倒入石英比色皿中，在325nm波長(zhǎng)下，從第1分鐘開(kāi)始，每隔30秒測(cè)一次光吸光度，測(cè)至第5分鐘。以吸光度為縱坐標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)繪制反應(yīng)曲線(xiàn)，計(jì)算鄰苯三酚自氧化速率k0（直線(xiàn)斜率）。
表1鄰苯三酚自氧化測(cè)定加樣表
試劑
0.1mol/LTris—HCl緩沖液（pH=8.2，內(nèi)含2mmol/LEDTA）
蒸餾水10mmol/LHCl
45mmol/L鄰苯三酚（內(nèi)含10mmol/LHCl）
總體積
加樣量（mL）校零管4.54.40.1——9.0
測(cè)定管4.54.4——0.19.0
�。�2）SOD酶活的測(cè)定：
在試管中按表2加入各試劑，加入鄰苯三酚后馬上計(jì)時(shí)，迅速搖勻倒入石英比色皿中，在325nm波長(zhǎng)下，從第1分鐘開(kāi)始，每隔30秒測(cè)一次光吸光度，測(cè)至第5分鐘。以吸光度為縱坐標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)繪制反應(yīng)曲線(xiàn)，計(jì)算加入SOD酶樣品后的鄰苯三酚自氧化速率k1（直線(xiàn)斜率）。
表2SOD酶活測(cè)定加樣表
試劑
0.1mol/LTris—HCl緩沖液（pH=8.2，內(nèi)含2mmol/LEDTA）
蒸餾水10mmol/LHCl待測(cè)樣
45mmol/L鄰苯三酚（內(nèi)含10mmol/LHCl）
總體積
加樣量（mL）校零管4.54.30.10.1——9.0
測(cè)定管4.54.3——0.10.19.0
�。�3）酶活力測(cè)定
酶活性單位定義為：在lml的反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定義為一個(gè)
活力單位。
按下式計(jì)算樣品中SOD酶單位活力：
k0-k1樣品液稀釋倍數(shù)
50%反應(yīng)液總體積?
加入樣品液體積單位體積活力（U/ml）=k0
活性單位定義體積
總活力（U）=單位體積活力?樣品液總體積
式中：反應(yīng)液總體積=9mL；樣品液稀釋倍數(shù)=1；加入樣品液體積=0.1mL；活性單位定義體積=1mLl；樣品液總體積=實(shí)驗(yàn)中各樣品實(shí)測(cè)體積。6、樣品中可溶性蛋白含量的測(cè)定
從1mL備用的提取液、粗酶液、酶液中分別取0.2mL、0.4mL、0.5mL，按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e測(cè)定稀釋液在260nm和280nm波長(zhǎng)處的吸光值，按下式計(jì)算可溶性蛋白的含量：
蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=(1.45A280–0.74A260)×稀釋倍數(shù)
總蛋白（mg）=蛋白質(zhì)濃度×樣品液總體積
五、結(jié)果與討論
將試驗(yàn)結(jié)果及相應(yīng)的計(jì)算結(jié)果填入下表：
相關(guān)計(jì)算公式：
力力；回收率=粗酶液（或酶液）總活比活力U/mg=總活力（U）；純化倍數(shù)=粗酶液（或酶液）比活
提取液總活力提取液比活力總蛋白（mg）
六、思考題
1、在SOD酶提取步驟中應(yīng)注意的關(guān)鍵問(wèn)題是什么？
2、綜合評(píng)價(jià)蛋白或酶的提取分離流程優(yōu)劣的指標(biāo)有哪些？
生物分離實(shí)驗(yàn)案例 2
茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定
儀器：紫外分光光度計(jì)，比色皿，天平，容量瓶，移液管，pH計(jì)、試管
藥品：沒(méi)食子酸丙酯或茶多酚，酒石酸鉀鈉，硫，沒(méi)食子酸丙酯，蒸餾水溶液，移入25mL容量瓶并稀釋至刻度，搖勻，配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液
A酒石酸亞鐵溶液配制
準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g硫酸亞鐵，和0.5g酒石酸鉀鈉，混合，蒸餾水溶解后移入100mL容量瓶，稀釋至刻度，搖勻。
pH7.5磷酸鹽緩沖液配制
磷酸氫二鈉：準(zhǔn)確稱(chēng)取分析純磷酸氫二鈉2.969g，蒸餾水稀釋溶解，移入250mL容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，為a液
磷酸二氫鉀：準(zhǔn)確稱(chēng)取分析純磷酸二氫鉀，、2.2695g，蒸餾水溶解，移入250mL容量瓶，定容，B。
取A液體85mL，B液體15mL混合均勻，即成。
B標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制
分別吸取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25mL的沒(méi)食子酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)液于25mL容量瓶中，加入蒸餾水4mL，再加入酒石酸亞鐵溶液5mL，用pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，分光光度計(jì)在540nm處，1cm比色皿，分別測(cè)定吸光度�？瞻讌⒈炔僮魍�，不加沒(méi)食子酸丙酯。以容量瓶中沒(méi)食子酸丙酯的`絕對(duì)含量mg為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，做線(xiàn)性回歸。
C樣品測(cè)定
取適量樣品加入容量瓶，操作同上，沒(méi)食子酸丙酯含量乘以換算系數(shù)1.5，求得茶多酚。
實(shí)驗(yàn)二超聲法和回流法提取茶多酚的比較
實(shí)驗(yàn)儀器：
超聲提取器、布氏漏斗、抽濾瓶、真空泵、燒瓶、量筒、分光光度計(jì)、比色皿、容量瓶等、實(shí)驗(yàn)試劑
茶葉、純凈水、茶多酚（沒(méi)食子酸丙酯）、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等
操作方法
1、材料準(zhǔn)備
稱(chēng)取一定量的茶葉，研缽粉碎。備用
2、提取
A、超聲提取法
稱(chēng)取5g粉碎后茶葉末，放入燒瓶（塑料袋密封），加入100mL水，于超聲提取器，50℃提取20min，抽濾，定容至100mL，待測(cè)。
B、回流提取法
稱(chēng)取10g粉碎后茶葉末，放入圓底燒瓶，加入100mL水，80℃提取40min，分別在1、3、5、7、10、15、20、30、40min取3mL樣品，小漏斗過(guò)濾后，待測(cè)。測(cè)得茶多酚含量（mg/mL）以茶多酚含量為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)。
3、含量測(cè)定
按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)定含量。
所需試劑及儀器
試劑：
沒(méi)食子酸丙酯或者茶多酚，酒石酸鉀鈉，硫酸亞鐵，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，儀器：
紫外分光光度計(jì)，水浴鍋，電子天平，pH計(jì)，超聲提取器，量筒（100mL*1），容量瓶（25mL*8，100mL*4，250mL*2），比色皿*5，移液管（1.0mL*2，0.5mL*2，2mL*2，5mL*4）三角瓶250mL*2，小漏斗*2，試管架
生物分離實(shí)驗(yàn)案例 3
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1. 學(xué)會(huì)提取和分離葉綠體中色素的方法。
2. 比較、觀(guān)察葉綠體中四種色素：理解它們的特點(diǎn)及與光合作用的關(guān)系
二、實(shí)驗(yàn)原理
光合色素主要存在于高等植物葉綠體的基粒片層上，而葉綠體中的色素能溶于有機(jī)溶劑中。故要提取色素，要破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，破壞葉綠體膜，使基粒片層結(jié)構(gòu)直接與有機(jī)溶劑接觸，使色素溶解在有機(jī)溶劑中。
葉綠體中的色素有四種，不同色素在層析液(脂溶性強(qiáng)的有機(jī)溶劑)中的.溶解度不同，因而隨層析液的擴(kuò)散速度也不同。
三、材料用具
取新鮮的綠色葉片、定性濾紙、燒杯、研缽、漏斗、紗布、剪刀、小試管、培養(yǎng)皿、毛細(xì)吸管、量筒、有機(jī)溶劑、層析液(20份石油醚、2份丙酮、1份苯混合)、二氧化硅、碳酸鈣。
四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程（見(jiàn)書(shū)Ｐ54）
1.提取色素：
2.制備濾紙條：
3.色素分離，紙層析法。（不要讓濾液細(xì)線(xiàn)觸及層析液）
4.觀(guān)察：
層析后，取出濾紙，在通風(fēng)處吹干。觀(guān)察濾紙條上出現(xiàn)色素帶的數(shù)目、顏色、位置和寬窄。結(jié)果是：4條色素帶從上而下依次是：胡蘿卜素(橙黃色)、葉黃素(黃色)、葉綠素a(藍(lán)綠色)、葉綠素b(黃綠色)。
五、討論
1.濾紙條上的濾液細(xì)線(xiàn)為什么不能接觸到層析液？
2．提取和分離葉綠體中色素的關(guān)鍵是什么？
生物分離實(shí)驗(yàn)案例 4
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1. 初步學(xué)會(huì)觀(guān)察植物細(xì)胞質(zhì)壁分離和復(fù)原的方法。
2. 理解植物細(xì)胞發(fā)生滲透作用的原理。
二、實(shí)驗(yàn)原理
當(dāng)細(xì)胞液的'濃度小于外界溶液的濃度時(shí)，細(xì)胞液中的水分就透過(guò)原生質(zhì)層進(jìn)入外界溶液中，使細(xì)胞壁和原生質(zhì)層都出現(xiàn)一定的收縮。由于原生質(zhì)層比細(xì)胞壁的收縮性大，當(dāng)細(xì)胞不斷失水時(shí)，原生質(zhì)層就會(huì)與細(xì)胞壁逐漸分離開(kāi)，也就是分升了質(zhì)壁分離當(dāng)細(xì)胞液的濃度大于外界溶液的濃度時(shí)，外界溶液中的水分就透過(guò)原生質(zhì)層進(jìn)入細(xì)胞液中，整個(gè)原生質(zhì)層就會(huì)慢慢地恢復(fù)成原來(lái)的狀態(tài)，使植物細(xì)胞逐漸發(fā)生質(zhì)壁分離復(fù)原。
三、材料用具
紫色洋蔥鱗片葉、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、滴管、鑷子、刀片、吸水紙、清水、0.3g/ml蔗糖溶液
四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程(見(jiàn)書(shū)P60)
物理實(shí)驗(yàn)報(bào)告 ——化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 ——生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告 ——實(shí)驗(yàn)報(bào)告格式 ——實(shí)驗(yàn)報(bào)告模板
五、討論
1.如果將洋蔥表皮細(xì)胞浸潤(rùn)在與細(xì)胞液濃度相同的蔗糖溶液中，這些表皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象?
2.當(dāng)紅細(xì)胞細(xì)胞膜兩側(cè)的溶液具有濃度差時(shí)，紅細(xì)胞會(huì)不會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象?為什么?
3.畫(huà)一個(gè)細(xì)胞在正常狀態(tài)下到經(jīng)過(guò)0.3g/ml蔗糖溶液處理，再經(jīng)過(guò)清水處理的細(xì)胞變化的一系列模式圖。
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